流式细胞凋亡

　　一、实验简介

　　磷脂酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂，正常情况下主要存在于细胞膜的内面。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，其变化之一是膜内的PS发生外翻，暴露在细胞膜外面。Annexin V是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和性。因此可以通过Annexin V与PS的结合检测细胞膜是否完整，以此判断细胞凋亡。

　　二、流式凋亡实验步骤

　　1、收集上清：收集培养液于流式管中(有少量悬浮细胞)。

　　2、收集细胞：六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1 ml无EDTA 0.25%胰酶，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，1500 rpm离心5 min，弃上清。

　　3、PBS洗涤细胞：加入3ml4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀用200μL的Binding Buffer重悬。

　　4、荧光标记：加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀。室温下避光反应15min。

　　5、于1 hour内上机检测：

　　Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。流式细胞仪参数如下：激发波长Ex=488nm，发射波长FL1(Em=525±20nm);FL2(Em=585±21nm)。用FlowJo软件分析细胞不同状态(主要是早凋、晚凋与死亡)的比例及数目。
 

　　结果展示：

Blank，对照组凋亡结果
 

OGD，实验组凋亡结果