流式细胞凋亡

流式细胞术 4460

  一、实验简介

  磷脂酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂,正常情况下主要存在于细胞膜的内面。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,其变化之一是膜内的PS发生外翻,暴露在细胞膜外面。Annexin V是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白,对PS具有高度亲和性。因此可以通过Annexin V与PS的结合检测细胞膜是否完整,以此判断细胞凋亡。

  二、流式凋亡实验步骤

  1、收集上清:收集培养液于流式管中(有少量悬浮细胞)。

  2、收集细胞:六孔板中的细胞用PBS洗涤一次,加入1 ml无EDTA 0.25%胰酶,待细胞变圆且有部分细胞悬浮,即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞,使细胞悬浮。收集于流式管中,1500 rpm离心5 min,弃上清。

  3、PBS洗涤细胞:加入3ml4℃预冷的PBS完全重悬细胞,1500 rpm离心5 min,弃上清。沉淀用200μL的Binding Buffer重悬。

  4、荧光标记:加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL Propidium Iodide,混匀。室温下避光反应15min。

  5、于1 hour内上机检测:

  Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测,PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。流式细胞仪参数如下:激发波长Ex=488nm,发射波长FL1(Em=525±20nm);FL2(Em=585±21nm)。用FlowJo软件分析细胞不同状态(主要是早凋、晚凋与死亡)的比例及数目。
 

  结果展示:

流式细胞凋亡
Blank,对照组凋亡结果
 

流式细胞凋亡
OGD,实验组凋亡结果

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