流式-JC-1

  一、实验简介

  线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种理想的用于检测线粒体膜电位的荧光探针,可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其原理是,当线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体基质中,形成聚合物,488nm激发时的最大发射波长为590nm,可以产生红色荧光,在流式上表现为FL1和FL2双阳性;当线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体基质中,此时JC-1为单体,488nm激发时最大发射波长为527nm,可以产生绿色荧光,形成流式图汇总所有细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。不同荧光颜色的转变反应线粒体膜电位的变化,常用红绿荧光的相对比例衡量线粒体去极化的比例。
 

  二、流式JC-1实验步骤

  1、收集细胞:细胞悬液转入离心管中,1000rpm离心5min收集细胞,弃上清。

  2、PBS洗涤细胞:加入3ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞,1000rpm离心5min,弃上清。沉淀震荡混匀。

  3、细胞计数:移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数,调整细胞为0.5-1×10^6/ml。

  4、装载探针:按照1:500用无血清培养基稀释JC-1,使终浓度为10ug/mL。

  5、孵育探针:37°C细胞培养箱内孵育20分钟,每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触,用无血清的培养液洗涤细胞三次,以去除未进入细胞内的探针。

  6、上机检测:流式细胞仪使用激发波长Ex=488nm,发射波长FL1(Em=525±20nm);FL2(Em=585±20 nm),用Flow Jo软件分析结果。
 

  结果展示:

流式-JC-1流式-JC-1

  如图所示,细胞经一定处理后,线粒体膜电位下降(右下象限比例增加,右上象限比例降低),细胞呈现早凋。

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