流式ROS检测

　　一、实验原理

　　活性氧簇ROS是由氧分子还原所形成的分子或者离子，大部分都是由线粒体产生的副产物，它们会在细胞代谢包括细胞内呼吸和底物氧化过程中产生。适量的ROS是细胞必需的，因为ROS参与维持细胞存活及生理功能所需的各种生活过程，如信号转导和基因表达，但过量或过少的ROS都会诱导氧化应激，破坏核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物和细胞膜等，导致细胞死亡和组织破坏。

　　DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，被水解生成DCFH。而DCFH不能透过细胞膜。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF被488nm激发光激发后，发射530nm的荧光信号，被FITC通道接收，检测DCF的荧光就可以判定细胞内活性氧ROS的水平。

　　二、实验步骤

　　1、收集细胞：细胞悬液转入离心管中，1500 rpm离心5 min收集细胞,弃上清。

　　2、PBS洗涤细胞：加入3ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。

　　3、细胞计数：移取10 ul在血细胞计数仪上进行细胞计数,调整细胞为1×10^6-2×10^8/ml。

　　4、装载探针：按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10umol/L。

　　5、孵育探针：37℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔3-5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，用无血清的培养液洗涤细胞三次，以去除未进入细胞内的探针。

　　6、上机检测：流式细胞仪使用激发波长488nm，发射波长525±20nm进行检测，用FlowJo软件分析细胞ROS水平。

　　三、结果分析

　　结果说明：平均荧光强度值越大，表明细胞内ROS含量越高。