流式ROS检测

流式细胞术 21460

  一、实验原理

 

  活性氧簇ROS是由氧分子还原所形成的分子或者离子,大部分都是由线粒体产生的副产物,它们会在细胞代谢包括细胞内呼吸和底物氧化过程中产生。适量的ROS是细胞必需的,因为ROS参与维持细胞存活及生理功能所需的各种生活过程,如信号转导和基因表达,但过量或过少的ROS都会诱导氧化应激,破坏核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物和细胞膜等,导致细胞死亡和组织破坏。

  DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞后,被水解生成DCFH。而DCFH不能透过细胞膜。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF被488nm激发光激发后,发射530nm的荧光信号,被FITC通道接收,检测DCF的荧光就可以判定细胞内活性氧ROS的水平。

  二、实验步骤

 

  1、收集细胞:细胞悬液转入离心管中,1500 rpm离心5 min收集细胞,弃上清。

  2、PBS洗涤细胞:加入3ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞,1500 rpm离心5 min,弃上清。沉淀震荡混匀。

  3、细胞计数:移取10 ul在血细胞计数仪上进行细胞计数,调整细胞为1×10^6-2×10^8/ml。

  4、装载探针:按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA,使终浓度为10umol/L。

  5、孵育探针:37℃细胞培养箱内孵育20 min,每隔3-5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触,用无血清的培养液洗涤细胞三次,以去除未进入细胞内的探针。

  6、上机检测:流式细胞仪使用激发波长488nm,发射波长525±20nm进行检测,用FlowJo软件分析细胞ROS水平。

  三、结果分析

 

流式ROS检测
 

样本编号 平均荧光强度
THP-1-nc.fcs 1395
THP-1-rosup.fcs 6221
THP-1.fcs 18397

  结果说明:平均荧光强度值越大,表明细胞内ROS含量越高。

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