荧光原位杂交（FISH、IF 双染）

　　项目介绍

　　原位杂交与免疫荧光原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。免疫荧光就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

　　应用

　　通过原位杂交及免疫荧光双染，可以在组织细胞中对核酸分子和蛋白指标同时进行共定位、以及定性分析，可以用来从共定位角度提示核酸和蛋白存在相互作用。

　　实验流程

　　石蜡切片荧光探针原位杂交与免疫荧光双标实验步骤

　　1. 组织固定、脱水、切片、石蜡切片脱蜡至水;

　　2. 消化：切片于修复液中煮沸10-15分钟，滴加蛋白酶K消化;

　　3. 预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

　　4. 杂交：倾去预杂交液，滴加含探针 杂交液, 浓度 ，恒温箱 度杂交过夜。

　　5. 杂交后洗涤：SSC洗涤;

　　6. 孵育一抗、二抗：滴加一抗，4℃过夜，后PBS洗3×5min;滴加相应二抗，室温孵育50min，PBS洗3×5min;

　　7. DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min;

　　8. 镜检拍照;

　　结果展示

　　样品保存运输

　　组织冰冻切片

　　组织切取需要部位，厚度在2mm 左右, PBS 漂洗，干冰运输或立即置于固定液中。组织固定有原位杂交固定液(动物)、原位杂交固定液(植物)、原位杂交固定液(较嫩植物)，室温固定12 小时(根据组织大小)以上，植物组织固定时需常温抽真空30min，再用纯水或PBS 清洗两次后， 放入15% 蔗糖溶液中，4℃脱水8 小后，换30% 蔗糖溶液4℃过夜。冰切时佩戴手套。冰冻切片放-20℃或-80℃ 保存备用。

　　组织石蜡切片

　　组织切取需要部位，厚度在2mm 左右, PBS 漂洗后立即固定。动物组织用原位杂交固定液(动物)，植物组织用原位杂交固定液(植物)或原位杂交固定液(较嫩植物)，植物组织固定时需常温抽真空30min，固定12h 以上。固定完成后脱水、包埋、切片。梯度酒精配制需用DEPC 水。石蜡常规保存备用。

　　标本运输

　　冰冻切片：标本放原位杂交固定液中，常温运输;冰冻切片-20℃运输;新鲜组织干冰运输。交接单随样本一起，单独封装。

　　石蜡切片：标本放原位杂交固定液中，常温运输;石蜡切片常温运输。交接单随样本一起，单独封装。

　　细胞爬片：细胞爬片加原位杂交固定液后密封4℃运输。交接单随样本一起，单独封装。

　　实验注意事项：

　　1. mRNA为检测对象时，需严格要求实验环境经无RNA酶处理;

　　2. FISH切片保存时间较短，应尽快取图;

　　3. 不同的抗体与原位杂交进行双标时，可能会有影响，必要时进行一定的实验步骤调整，以避免相互之间的影响;