Edu染色试剂盒（粉，AF647)

产品名称	产品货号	规格	有效期
EdU染色试剂盒（粉，AF647）	HKI0023	100T	一年

【产品简介】
EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)，中文名为 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其炔羟基团在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够替代胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine) 插入正在复制的DNA分子中，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如AzideAlexaFluor488等)通过一价铜离子催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Clickreaction)，从而可以进行高效快速的检测细胞增殖，特别是可以有效地检测处于S期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比，EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。
【储存与运输】
冰袋运输，-20˚C 储存，可稳定储存一年

【试剂组成】

动物EdU注射

对于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使50mg/kg的浓度进行测试。

注射方式:依据客户实验而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾静脉注射等，其中以腹腔注射为多。6小时后或根据特定实验确定适当的时间后，快速处死小鼠，取出所需组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时候也可参考相关文献自行调整。

建议任何实验均可取小肠组织检测细胞增殖情况，小肠上皮组织细胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小时后即可检测到阳性信息，可用作阳性对照进行预实验。

切片处理

切片前处理：组织器官最好进行清洗，以去除血液、组织中残留的EdU，降低背景。

切片厚度：3-10μm为宜，切片过厚可能会影响切片背景及染色效率。

切片后处理：

石蜡切片脱蜡：二甲苯脱蜡2次，15分钟/次，梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）各一次，5分钟/次，去离子水洗脱1次。

冰冻切片处理：室温放置30分钟后，固定10分钟，PBS清洗3次，每次5分钟。

细胞实验

细胞 EdU标记

用细胞完全培养基和EdU母液按8000：1的比例稀释，制备适量50μM的EdU培养基；

每孔加入适量50μM的EdU培养基孵育2小时，弃培养基（最佳孵育时间一般为细胞周期的1/10）,PBS清洗细胞3次，每次5分钟，EdU培养基和EdU反应液孵育体积可参考下表；

	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	5.5cm小皿
EdU培养基	100μL	200μL	300μL	500μL	1mL	2mL
EdU反应液	100μL	200μL	300μL	500μL	1mL	2mL

细胞固定通透

每孔加入细胞固定液（含4%的多聚甲醛的PBS）室温孵育15分钟，弃固定液，PBS 清洗3次，每次5分钟；

每孔加入渗透剂(0.5%TritonX-100 的 PBS)脱色摇床孵育15分钟；PBS 清洗3次，每次5分钟。

Edu反应

按照PB：CU：AC：色原=860：40：100：5的比列配制EdU反应液（反应液现配现用）。

每个样本滴加50-100μL的EdU染色反应液（反应液均匀覆盖样本），室温避光孵育15-60分钟，弃染色反应液，PBS冲洗3次，每次5分钟。

DAPI染色

每片组织加入50-100ul DAPI染色液，染色15分钟，PBS洗脱三次，每次5分钟。

图像拍照

染色完成后建议立刻观察，使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或者全片扫描仪进行采集图像，染色完玻片避光4℃保存。

实验前须知

EdU 的分子量为 252.23，易溶于水、PBS、生理盐水。对于动物实验，如使用自备EdU粉末，建议将 EdU 粉末溶解于DMSO配制成 100mg/ml的母液。EdU建议初始给药量为50mg/kg（50μg/g），稀释浓度为 0.5~1mg/mL。小鼠体重20g，需要注射1mg，以1mg/mL计算，需要注射1mL。

Edu	0.1mg	1mg	2mg	10mg
PBS	100μL	1mL	2mL	10mL

对于细胞实验，EdU母液质量浓度为100mg/mL，转化为物质的量浓度为400mM，待使用时用细胞完全培养基和EdU母液按8000：1的比例稀释，制备适量50μM的EdU培养基（50μM为推荐浓度。由于细胞类型、培养基种类、细胞密度和增殖速度等多种因素会显著影响EdU在细胞中的掺入量。因此，在首次使用EdU时，建议对其使用浓度进行一些探索和调整。如果您之前已经使用BrdU进行过实验，可以将BrdU的终浓度作为EdU的参考浓度）。

【注意事项】

1. 对于体外培养细胞，具体 EdU 使用浓度、孵育时间随样品以及研究目的的不同，可进行 适当调整。

2. 部分组织细胞增殖速度缓慢，为了排除造模效果不佳等因素，建议选增殖快的组织样品作 为参照样本 (如肠道组织)

3. 如果背景颜色过深，可能是实验中洗涤不充分、组织样品固定时间过长、固定液残余导致。

4. 催化剂 AC 颜色发生轻微变化，点击反应催化体系依旧能够正常进行，如呈现棕色，表明 该组分已失效，请弃用。

5. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。