【储存与运输】

冰袋运输；蛋白标准品 (BSA) 4℃保存，有效期 12 个月。配制成的蛋白标准溶液后需 -20℃ 保存，并在 6 个月内使用。其余试剂常温保存，有效期 12 个月。

【使用方法】

1. 配制蛋白标准贮备液：取 1 mL 蛋白标准配制液加入到蛋白标准品 (BSA) 蛋白标准管

中，将 25 mg 蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为 25 mg/mL 的蛋白标准贮备液。配制成的蛋 白标准溶液可-20℃ 长期保存。

2. 配制蛋白标准工作液：取适量 25 mg/mL 蛋白标准贮备液，用 PBS 或生理盐水稀释 50

倍，得到终浓度为 0.5 mg/mL 的蛋白标准工作液。注意稀释时按照 10 倍梯度方法稀释，确保 稀释准确。

3. 绘制标准曲线 (酶标仪法) ：将蛋白标准工作液分别按 0，1，2，4，8，12，16，20 μ L 加到 96 孔 板中，然后用 PBS 或生理盐水依次加 20，19，18，16，12，8，4，0 μL 将上 述梯度工作液补足到 20 μL。得到蛋白浓度依次为 0，25，50，100，200，300，400，500 μ g/mL 的梯度曲线。

4. 准备待测样品：将待测的蛋白样品进行适当稀释 (可通过预实验检测，使样品蛋白浓度 在标准曲线范 围内，确保检测结果可信) ，按照每个样品 20 μL 的量加到 96 孔板中。待测 样品与蛋白标准品用相 同溶液稀释。

5. 配制 BCA 显色工作液：将 BCA 试剂与硫酸铜溶液按照 50:1 体积比充分混合均匀， 得到 BCA 显色工作液。BCA 显色工作液可室温保存，24 h 内使用。每个待测样品需 200 μL ，建议按需配制，避免浪费。

6. 检测：向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入 BCA 显色工作液 200 μL，充分混 匀 (可将 96 孔板放在振荡器上振荡 30 s) ，37℃反应 30 min 后，以标准曲线 0 号做参比 ，在 562 nm 波长下比色测定，  记录各孔吸光度值。  (注：也可以在室温反应 2 h，或 60℃ 反应 30 min。如果蛋白浓度较低，建议置 于 60℃反应)

7. 计算：以标准曲线中梯度蛋白含量 ( μg/mL) 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准 曲线。根据所测 样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度 ( μg/mL ) ，再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。议按需配制，避免浪费。

【注意事项】

1.BCA 法测定蛋使用 BCA 蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色 反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量，若显色反应时间和温 度无法精确控制，宜每次都做标准曲线。

2.在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议 10 倍梯度稀释，  不要一次稀释 50 倍，以免产生较大误差。

3.低温或长期保存，若发现 BCA 试剂 A 或者试剂 B 有沉淀发生。请 37ºC 温育并伴随搅 拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应舍弃，避免对实验结果造成影响。

4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。