免疫组化双染

【产品信息】

• 实验原理

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(IHC)或免疫细胞化学技术(ICC)。 

• 实验器材及试剂

1.主要实验器材

2.主要实验试剂

• 实验步骤
• 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min -无水乙醇Ⅰ6min- 95%酒精6min- 85%酒精6min，自来水洗2min。
• 抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复液EDTA(9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸腾停火8min再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
• 阻断内源性过氧化物酶：切片加上3%的双氧水，室温孵育25min，将玻片置PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
• 画圈：用组化专用的组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的PBS保证后续依次加入的封闭血清，一抗，二抗，以及显色剂能完全覆盖组织，而不沿着玻片流走。
• 血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。
• 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒4°过夜孵育。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与超敏兔鼠通用二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
• 显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加解冻的TY反应液反应20min，然后PBS洗三次，之后加入红色显色液工作液（PB:CU:红色色原：AC=860:40:1:100），显微镜下控制显色时间，阳性为红色，纯水冲洗切片终止显色。(时间较长15min左右)，再重复2-7的操作步骤。
• 抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复液EDTA(9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸腾停火8min再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
• 阻断内源性过氧化物酶：切片加上3%的双氧水，室温孵育25min，将玻片置PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
• 画圈：用组化专用的组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的PBS保证后续依次加入的封闭血清，一抗，二抗，以及显色剂能完全覆盖组织，而不沿着玻片流走。
• 血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。
• 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒4°过夜孵育。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与超敏兔鼠通用二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
• DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加（稀释液和浓缩液1000:50配制）新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。
• 复染细胞核：苏木素染色2-3mins左右，自来水洗，苏木素分化液分化2秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝15-30s，流水冲洗。
• 脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min -95%酒精5min -无水乙醇5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
• 显微镜镜检，图像采集分析。
• 结果判读：

苏木素染出细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色，红色显色试剂呈粉红色

• 注意事项：

1． 注意切片脱蜡是否彻底；

2． 实验过程中切片勿干片；

3.  实验操作中小心枪头挂伤组织。

2． 实验过程中切片勿干片；

3.  实验操作中小心枪头挂伤组织。