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石蜡切片免疫荧光实验报告

一、实验器材及试剂

1. 实验器材

• 主要实验试剂

• 石蜡切片免疫荧光实验步骤
• 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min-无水乙醇Ⅰ6min- 95%酒精6min-85%酒精6min-蒸馏水洗。
• 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA修复液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min停火8min中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
• 阻断内源性过氧化物酶：切片加上3%的双氧水，室温孵育25min，将玻片置PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
• 血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。
• 加一抗：切片稍甩干后在圈内滴加按一定比例稀的抗体覆盖组织。切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
• 信号放大:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。滴加相对应颜色Flare信号放大试剂，3-5min.将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。
• DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
• 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
• 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像，根据对应波长选择相应通道。