荧光四标信号放大试剂盒

【产品信息】

产品名称	产品货号	100T	保存	有效期
TSA-Flare520(即用型)	HKI0014	5mL	-20℃	12个月
TSA-Flare570(即用型)	HKI0015	5mL	-20℃
TSA-Flare620(即用型)	HKI0016	5mL	-20℃
TSA-Flare690(即用型)	HKI0017	5mL	-20℃
HRP羊抗兔1000x	B29001T	100uL	-20℃
HRP羊抗鼠1000x	B29002T	50uL	-20℃
POLY-HRP羊抗兔/鼠(即用型)(可选)	HKI0029	5mL	4℃
DAPI染色液(即用型)	HKI0005	10mL	4℃
抗荧光淬灭封片剂	HKI0007	10mL	4℃
内源性过氧化物酶阻断剂	HKI0047	20mL*2	4℃
抗体洗脱液	HKI0045	20mL*2	4℃

【产品简介】

TSA荧光多色染色试剂盒，核心原理是基于高效的酪酰胺信号放大技术（简称TSA技术），广泛适用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片、类器官等多种组织样本的免疫荧光多重染色实验。本试剂盒通过荧光标记酪胺盐在辣根过氧化物酶（HRP）催化过氧化氢（H₂O₂）的作用下，与周围的蛋白残基形成稳定共价键结合位点，再结合抗体洗脱液的抗体洗脱技术，可高效实现多重荧光染色，兼顾检测稳定性与实验便捷性。

（冰冻切片、细胞爬片需要配合抗体洗脱液HKI0045使用）

【储存与运输】

冰袋(wet ice)运输。试剂盒内各组分按各自所需条件保存，12个月有效。

【荧光光谱】

荧光染料类型	激发波长/nm	发射波长/nm
DAPI	364	454
TSA-Flare480	450	480
TSA-Flare520	490	520
TSA-Flare570	550	570
TSA-Flare620	590	620
TSA-Flare690	630	690
TSA-Flare780	750	780

【试剂准备】

1. 自备环保型脱蜡透明液（HK2069A）；
2. 自备无水乙醇；
3. 自备抗原修复液：根据抗体与组织类型选择，可选柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）（HKI0001）、Tris-EDTA抗原修复液（pH 8.0）（HKI0003）或Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0）（HKI0004）；
4. 自备PBS磷酸盐缓冲液（HK0002）；
5. 自备封闭用试剂，推荐使用：3% BSA(HKW2099）、兔血清（HKI0009R）、山羊血清（HKW2085）；
6. 自备抗体稀释液（HKW2083）；
7. 自备实验所需一抗；
8. 试剂盒标配5 mL高灵敏度POLY-HRP羊抗鼠/兔二抗（即用型）。若需全程采用多聚酶标二抗，请自备以下即用型试剂：POLY-HRP羊抗鼠/兔HKI0029（即用型）；POLY-HRP羊抗鼠HKI0027（即用型）；POLY-HRP羊抗兔HKI0026（即用型）。
9. 冰冻切片需要自备丙酮或甲醇/丙酮混合液；
10. 细胞样本需要自备4%多聚甲醛（HK2003）。

【仪器准备】

1. 脱色摇床；
2. 湿盒；
3. 微波炉/抗原修复仪；
4. 荧光显微镜/共聚焦显微镜/多通道荧光扫描仪；
5. 修复盒；
6. 免疫组化笔(HKI0025)；
7. 盖玻片。

【使用方法】

1. 样本准备

1. 石蜡切片：环保型脱蜡液Ⅰ 10min→环保型脱蜡液Ⅱ 10min→环保型脱蜡液Ⅲ 10min→无水乙醇Ⅰ 5min→无水乙醇Ⅱ 5min→95%乙醇 5min→85%乙醇 5min→75%乙醇 5min，蒸馏水洗2次（1 min/次）。
2. 冰冻切片：冰冻切片恢复室温后，固定10～30min(丙酮或甲醇/丙酮混合液或4%多聚甲醛)，PBS洗涤3次(5 min/次)。
3. 细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本4%多聚甲醛室温固定10～30min，PBS洗涤3次（5 min/次）。

2. 抗原修复

1. 依据组织类型及抗体特性，遵循“修复液pH值越高（EDTA 9.0 >EDTA 8.0 > 柠檬酸 6.0） 物理作用越强（高压修复 > 微波修复 > 水浴修复 > 酶修复） ”的原则选择适配方案。
2. 常规切片置于修复盒中，加入200 mL EDTA 9.0修复液，密封防蒸发。采用分段微波修复法：中高火8 min → 静置7 min → 中低火8 min(全程严禁干片) 。自然冷却后，切片浸入PBS (pH 7.4)，于摇床振荡洗涤3次(5 min/次） 。
3. 冰冻切片：冰冻切片滴加0.3%TritonX-100破膜液通透20min(检测膜表达蛋白可省略此步) ，PBS洗涤3次（5 min/次）。
4. 细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本滴加0.3% Triton X-100破膜液通透20min(检测膜表达蛋白可省略此步) ，PBS洗涤3次（5 min/次）。

3. 画圈和双氧水封闭

切片沥干后，以组化笔沿组织边缘约 3 mm 处划定反应区域，待干后以纯水或 PBS 润湿。滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温避光孵育 15 min。随后将玻片浸入 PBS (pH 7.4) ，于摇床振荡洗涤3次（5 min/次） 。

4. 封闭

切片稍微甩干后，向组织上滴加3% BSA或血清室温封闭30 min。

5. 孵育一抗

弃去封闭液，滴加经抗体稀释液配制的一抗。将切片置于含湿润环境的避光湿盒中，于4°C孵育过夜或37°C孵育1-2 h(盒内加水以防液体蒸发)

6. 孵育二抗

切片经PBS (pH 7.4) 振荡洗涤3次(5 min/次)，稍沥干后滴加适配一抗种属的二抗(或即用型POLY-HRP羊抗鼠/兔多聚二抗)。室温避光孵育40-60 min。

7. TSA显色

切片经PBS (pH 7.4) 振荡洗涤3次(5 min/次)。每张切片滴加50–100 μL显色液覆盖组织，室温反应3–10 min。反应结束后，以PBS洗涤3次(5 min/次)。

8. 抗体洗脱

切片滴加足量抗体洗脱液完全覆盖组织（抗体洗脱液需要预热至37℃），37℃放置 8分钟，弃去洗脱液，再次滴加足量抗体洗脱液完全覆盖组织，37℃放置8分钟，弃洗脱液，PBS洗涤3次（5 min/次），洗脱掉一抗及相应二抗（核标记抗体可将每次孵育时间延长到10分钟）。

9. 荧光多标

重复3-8步骤，在步骤7中依次换用不同荧光染料，每重复一次完成一轮标记，直至完成第四轮标记，第四轮标记重复3-7步骤，无需抗体洗脱。

10. DAPI复染细胞核及封片

切片沥干后，滴加DAPI染色液，室温避光孵育10 min。PBS洗涤3次（5 min/次），稍沥干，使用抗荧光淬灭封片剂封片。

11. 拍照扫描

采用荧光显微镜、共聚焦显微镜、多通道扫描仪或多光谱成像系统进行观察与成像。

【注意事项】

1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【Source of Reagents】

发表[中文论文]请标注：荧光四标信号放大试剂盒(HKI0000-4A)由杭州浩克生物技术有限公司提供。 

发表[英文论文]请标注：荧光四标信号放大试剂盒(HKI0000-4A) was kindly provided by Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.