质粒大提(甘油菌)

PCR 8880

  简介:

  质粒转化:携带外源DNA片段的质粒进入感受体细胞后,在细胞中进行自我复制。多用于后期提取质粒。

  质粒提取:即去除 RNA,将质粒与细菌基因组DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。目前实验室涉及较多的为大量提取和小量提取。

  实验步骤:(以质粒样本提取大量质粒为例)

  1. 从-80℃冰箱中取出对应的感受态细胞,室温下置于冰盒上解冻,标记;

  2. 向感受态细胞中加入2µl的质粒,置于4℃冰箱中,冰浴30min;

  3. 在42℃水浴锅中热激90s,然后立即在冰盒上放置2min;

  4. 每管加1mL LB培养基,37℃摇床震荡,220rpm×30min;

  5. 取100µl 转化液加入对应抗性的平板中,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;

  6. 将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

  7. 挑选克隆子接种于1mL含对应抗性的LB液体培养基,37℃,220rpm振荡培养过夜。

  8. 按1/1000的比例,接种于200mL对应抗性的LB液体培养基,37℃,220rpm振荡培养过夜。

  9. 4℃下8000rpm离心收集菌体,用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒。

  实验周期:7个工作日

  实验要求:甘油菌50ul;质粒样品,20ng/ul,20ul。干冰运输。

  注明甘油菌和质粒的抗性。

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