细胞转染

　　一、实验简介

　　细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等，理想的转染方法是具有高转染效率、对细胞毒性作用小等。其中脂质体转染是常用的简便转染方法。

　　脂质体(liposome)转染方法的原理在于，阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹，形成DNA-脂复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附。再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔通过直接渗透作用，将DNA转运至细胞内，形成包涵体或进入溶酶体。当DNA从包涵体内释放后，进入细胞质，再进一步进入核内实现转录、表达。

　　二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验步骤(以6孔板为例)

　　1 转染前一天接种细胞于6孔板，5×104每孔，第二天转染时细胞汇合度达到60%-70%每孔。

　　2 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基1.9 ml。

　　3 A液：RNA100pmol/DNA 2μg(根据核酸类型不同，用量不同)加入50 ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静置5min。

　　4 B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体5ul 加入50 ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静置5min。

　　5 B液加入到A液中，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

　　6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃。

　　7 孵箱37℃培养4~6h，然后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。

　　8 mRNA 水平的检测：在转染后24-48h后，用Real-time PCR的方法在mRNA水平进行检测。

　　9 蛋白水平的检测：在转染后48-72h后，用Western-blot或免疫组化的方法在蛋白水平进行检测。