细胞转染

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  一、实验简介

  细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等,理想的转染方法是具有高转染效率、对细胞毒性作用小等。其中脂质体转染是常用的简便转染方法。

  脂质体(liposome)转染方法的原理在于,阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹,形成DNA-脂复合体,被表面带负电荷的细胞膜吸附。再通过膜的融合或细胞的内吞作用,偶尔通过直接渗透作用,将DNA转运至细胞内,形成包涵体或进入溶酶体。当DNA从包涵体内释放后,进入细胞质,再进一步进入核内实现转录、表达。

  二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验步骤(以6孔板为例)

  1 转染前一天接种细胞于6孔板,5×104每孔,第二天转染时细胞汇合度达到60%-70%每孔。

  2 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基1.9 ml。

  3 A液:RNA100pmol/DNA 2μg(根据核酸类型不同,用量不同)加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。

  4 B液:脂质体使用前轻轻混匀,脂质体5ul 加入50 ul Opti-MEM无血清培养基,轻轻混匀,室温静置5min。

  5 B液加入到A液中,用枪轻轻混匀,室温静止20min。

  6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中,边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃。

  7 孵箱37℃培养4~6h,然后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。

  8 mRNA 水平的检测:在转染后24-48h后,用Real-time PCR的方法在mRNA水平进行检测。

  9 蛋白水平的检测:在转染后48-72h后,用Western-blot或免疫组化的方法在蛋白水平进行检测。

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