Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

【产品信息】

【产品简介】

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 是一种用于细胞增殖/毒性检测的试剂。本产品使用一种高度水溶性的四唑盐WST-8，在电子偶联试剂的介入下，将活细胞中丰富的脱氢酶还原为橙红色的甲臜（formazan），可溶于培养基中。甲臜（formazan）的量与活细胞的数量成正比。与其他常见的四唑盐如 MTT、MTS、XTT 和 WST-1 相比，CCK-8 具有更高的灵敏度和稳定性。

【储存与运输】

短途冰袋（wet ice）运输，储存在-20°C避光处，可稳定保存1年。若经常使用，储存在4°C避光处，可稳定保存至少3个月。

【使用方法】

1. 细胞活力检测

1) 将细胞（100 μL/孔）接种于 96 孔板中。

2) 向每个孔中加入 10 μL CCK-8。

3) 将板放入培养箱中孵育 1-4 小时。

4) 使用酶标仪测定 450 nm 的吸光度。

*注意：操作时要小心，避免在孔中产生气泡，因为气泡会干扰检测。孵育时间可根据具体实验调整。如果不能立即测定吸光度，可向每孔加入 10 μL 1% w/v SDS 或 0.1 M HCl，覆盖并在室温避光保存。24 小时内吸光度保持不变。

• 细胞增殖/毒性测定
• 在96孔板的每个孔中接种100 μL的细胞悬液（约5000个细胞/孔）。在细胞培养箱中孵育24小时。
• 向孔中加入10 μL不同浓度的化合物。
• 根据实验设计，将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如 6、12、24 或 48 小时）。
• 向每个孔中加入 10 μL CCK-8。
• 将板放入培养箱中，孵育 1-4 小时。
• 使用微孔板读数仪在 450 nm 处测量吸光度。

*注意：操作时要小心，避免在孔中产生气泡，因为气泡会干扰检测。孵育时间可根据具体实验调整。如果不能立即测定吸光度，可向每孔加入 10 μL 1% w/v SDS 或 0.1 M HCl，覆盖并在室温避光保存。24 小时内吸光度保持不变。

• 数据分析

细胞活力（%）= [ (As-Ab) / (Ac-Ab) ] × 100%

抑制率（%）= [ (Ac-As) / (Ac-Ab) ] × 100%

As = 实验组吸光度（含细胞、培养基、CCK-8及待测化合物的孔吸光度）

Ab = 空白组吸光度（含培养基和CCK-8的孔吸光度）

Ac = 对照组吸光度（含细胞、培养基和CCK-8的孔吸光度）

• 标准曲线（可选）
• 在计数细胞后，使用细胞培养基将细胞悬液稀释成一系列浓度梯度，通常每组需要 5-7 个浓度梯度，每个梯度三重复。像往常一样将细胞接种到 96 孔板中。
• 孵育直到细胞贴壁（通常为2-4小时），然后每100 μL培养基加入10 μL CCK-8。继续孵育1-4小时，并使用酶标仪在450 nm测量吸光度。以细胞数量为X轴坐标，OD值为Y轴坐标制作标准曲线。根据该曲线，可以确定待测样品中的细胞数量。使用此标准曲线的前提是培养条件相同。

*注意：关注每个孔中的细胞数量。如果细胞悬液在管中被稀释，加入板之前请再次仔细混合细胞。每个孔中的细胞悬液体积应保持一致。

【注意事项】

1. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μL培养基）。对于白细胞，由于敏感性低，每孔至少需要2500个细胞（100 μL培养基）。96孔板每孔推荐的最大细胞数为25000个。如果在此测定中使用24孔或6孔板，应当相应地计算每个孔的细胞数，并调整CCK的体积以达到总量。

2. WST-8 可能会与还原剂反应生成 WST-8 甲臜。请检查甲臜的背景光密度（O.D.）。请检查在细胞毒性测定或细胞增殖测定中使用的还原剂。

3. 严格注意控制气泡的产生，因为它们会干扰光密度（O.D.）读数。

4. 在600 nm或更高处测量并减去样品的光密度（O.D.），如果存在高浊度的悬液，则从样品的O.D.中减去背景O.D.（需要用相同溶液做Blank组）。

5. 通过从每个孔的吸光值中减去空白溶液的吸光值，可以去除培养基中酚红的吸光值。因此，含有酚红的培养基可用于CCK-8测定（Blank组用培养基）。

6. CCK-8 的毒性非常低，相同的细胞可以用于其他细胞增殖测定，例如在完成 CCK-8 测定后进行结晶紫测定、中性红测定或 DNA 荧光测定。（不推荐）

7. 试剂盒可以用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。

8. 我们建议在培养皿的中心附近接种细胞，培养液在最外围孔槽中。培养皿的最外围孔槽容易蒸发，你可以用PBS或水填充这些孔槽。

9. 试剂中加入金属离子可能会影响CCK-9。试剂中加入金属离子可能会影响CCK-8的敏感性。

10. 为了您的安全和健康，请在实验期间穿实验服和戴手套。

11. 仅限研究使用。不得用于临床诊断或临床试验。