ELISA实验操作流程

　　按试剂盒说明书进行操作，不同指标操作不一样。具体以订购的试剂盒说明书为准。基本步骤如下：

　　1.包被：用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/ml。在聚苯乙烯酶标板的每孔加100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。(一般商品化的试剂盒中已包被好抗体，此步骤可省略)

　　2.封闭：每孔加入200ul封闭液，37℃或室温孵育1-2 h。

　　3.洗涤：小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3-5遍。也可以手动洗板：弃去液体，每孔加入300ul洗液，浸泡1-2min，在吸水纸上拍干，重复3-5遍。(一般商品化的试剂盒中已包被好抗体，前三个步骤可省略)

　　4.加样：加适当稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中。(同时做空白孔，倍比稀释的标准品孔，有条件可加做阴性对照孔及阳性对照孔作为质控点)。

　　5.温育：用封板膜封板后置37℃孵育1-2 h。

　　6.洗涤：同步骤3。

　　7.加抗体：于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100 μl。

　　8.温育：用封板膜封板后置37℃孵育1 h。

　　9.洗涤：同步骤3。

　　10.加酶结合物：于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100 μl。

　　11.温育：用封板膜封板后置37℃避光孵育30 min。

　　12.洗涤：同步骤3。

　　13.加显色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反应10～30min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。

　　14.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸100 μl，颜色由蓝色变为黄色。

　　15.结果测定：10min内，在酶标仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

　　二、ELISA结果计算

　　根据标准品的浓度和OD值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度。

　　三、注意事项

　　1、样本要求：样本应清澈透明，悬浮物应离心去除;避免使用溶血、高血脂样本。样本收集后若不立即检测，冻存于-80°冰箱，避免反复冻融。样本每次检测使用前要混匀，用完后将相应版布局及样本编号记录在实验本上，样本及时放入冰箱。

　　2、实验前准备

　　1.对应订单找到相应的样本和试剂盒。

　　2.核对样本个数、种类、编号、样本量是否足够，核对试剂盒种属、个数、日期，确定试剂盒是否够用、有没有过期。

　　3.注意订单上备注栏客户的要求，是否做复孔等。(以上三点有问题在实验前及时与销售沟通)

　　注：安排好时间，注意实验节奏，做好相应的记录帮助记忆，安排要有条理。

　　3、操作要求

　　1.试剂盒在使用前要平衡到室温，底物在使用前应保存在暗处，避光;

　　2.正式实验前需做预实验确定合适的稀释倍数，做预实验前注意说明书上建议稀释倍数。预实验双抗夹心法选取标曲最高两个点，竞争法选取标曲最高点与最低点，选取两个样本根据建议稀释倍数稀释三个梯度;

　　3.孵育温度与时间准确;洗板非常重要，每步洗板都一定要洗干净;

　　4.标准品在用前稀释，且稀释的每一步都要混匀，注意标曲的起始浓度是否与重溶浓度一致;

　　5.点样量一定要精确，完全打尽移液枪内样本与试剂，快速、等量的将试剂分配到各个微孔中;

　　6.抗体和HRP稀释倍数要严格按照说明书规定稀释;

　　7.各步骤之间，需用封板贴密封反应板避免蒸发;实验一旦开始，应连续完成所有的实验步骤，切勿中断。

　　4、常用各个厂家试剂盒操作不同及需注意的地方

　　欣博盛：抗体和HRP都是30倍稀释，且实验中每步都要洗板5次

　　eBiosience(备货需包板)：包被液用前需稀释10倍，稀释液用之前要稀释5倍，包被抗体检测抗体以及HRP都是250倍稀释。用前要提前算好所需试剂量，包被4度过夜，反应温度为室温。

　　联科/eBiosience(商品已包被)：标准品稀释液与样本稀释液不是通用稀释液;检测缓冲液用之前要稀释;加样前需要洗板，在板干之前加样且标准品样本和抗体连续加入，操作不要中断，反应温度为室温摇床。

　　优尔生/华美：加样孵育后加抗体之前不需要洗板，加完抗体孵育后加HRP之前洗板3次，加完HRP孵育后显色前洗板5次。华美试剂盒标准品稀释液与样本稀释液为通用稀释液，优尔生没有样本稀释液，一般用PBS稀释。

　　注：以上均为常见的试剂盒厂家，进口试剂盒及竞争法试剂盒仔细核对说明书后操作。