ELISA实验操作流程

  按试剂盒说明书进行操作,不同指标操作不一样。具体以订购的试剂盒说明书为准。基本步骤如下:

  1.包被:用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/ml。在聚苯乙烯酶标板的每孔加100μl,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。(一般商品化的试剂盒中已包被好抗体,此步骤可省略)

  2.封闭:每孔加入200ul封闭液,37℃或室温孵育1-2 h。

  3.洗涤:小心揭掉封板膜,放入洗板机,洗涤3-5遍。也可以手动洗板:弃去液体,每孔加入300ul洗液,浸泡1-2min,在吸水纸上拍干,重复3-5遍。(一般商品化的试剂盒中已包被好抗体,前三个步骤可省略)

  4.加样:加适当稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中。(同时做空白孔,倍比稀释的标准品孔,有条件可加做阴性对照孔及阳性对照孔作为质控点)。

  5.温育:用封板膜封板后置37℃孵育1-2 h。

  6.洗涤:同步骤3。

  7.加抗体:于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100 μl。

  8.温育:用封板膜封板后置37℃孵育1 h。

  9.洗涤:同步骤3。

  10.加酶结合物:于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100 μl。

  11.温育:用封板膜封板后置37℃避光孵育30 min。

  12.洗涤:同步骤3。

  13.加显色底物:于各孔中加入TMB底物溶液100 μl,37℃避光反应10~30min,直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。

  14.终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸100 μl,颜色由蓝色变为黄色。

  15.结果测定:10min内,在酶标仪上,于450nm处,以空白对照孔调零后测各孔OD值。

  二、ELISA结果计算

  根据标准品的浓度和OD值做标准曲线,然后根据标准曲线方程计算出样本浓度。

  三、注意事项

  1、样本要求:样本应清澈透明,悬浮物应离心去除;避免使用溶血、高血脂样本。样本收集后若不立即检测,冻存于-80°冰箱,避免反复冻融。样本每次检测使用前要混匀,用完后将相应版布局及样本编号记录在实验本上,样本及时放入冰箱。

  2、实验前准备

  1.对应订单找到相应的样本和试剂盒。

  2.核对样本个数、种类、编号、样本量是否足够,核对试剂盒种属、个数、日期,确定试剂盒是否够用、有没有过期。

  3.注意订单上备注栏客户的要求,是否做复孔等。(以上三点有问题在实验前及时与销售沟通)

  注:安排好时间,注意实验节奏,做好相应的记录帮助记忆,安排要有条理。

  3、操作要求

  1.试剂盒在使用前要平衡到室温,底物在使用前应保存在暗处,避光;

  2.正式实验前需做预实验确定合适的稀释倍数,做预实验前注意说明书上建议稀释倍数。预实验双抗夹心法选取标曲最高两个点,竞争法选取标曲最高点与最低点,选取两个样本根据建议稀释倍数稀释三个梯度;

  3.孵育温度与时间准确;洗板非常重要,每步洗板都一定要洗干净;

  4.标准品在用前稀释,且稀释的每一步都要混匀,注意标曲的起始浓度是否与重溶浓度一致;

  5.点样量一定要精确,完全打尽移液枪内样本与试剂,快速、等量的将试剂分配到各个微孔中;

  6.抗体和HRP稀释倍数要严格按照说明书规定稀释;

  7.各步骤之间,需用封板贴密封反应板避免蒸发;实验一旦开始,应连续完成所有的实验步骤,切勿中断。

  4、常用各个厂家试剂盒操作不同及需注意的地方

  欣博盛:抗体和HRP都是30倍稀释,且实验中每步都要洗板5次

  eBiosience(备货需包板):包被液用前需稀释10倍,稀释液用之前要稀释5倍,包被抗体检测抗体以及HRP都是250倍稀释。用前要提前算好所需试剂量,包被4度过夜,反应温度为室温。

  联科/eBiosience(商品已包被):标准品稀释液与样本稀释液不是通用稀释液;检测缓冲液用之前要稀释;加样前需要洗板,在板干之前加样且标准品样本和抗体连续加入,操作不要中断,反应温度为室温摇床。

  优尔生/华美:加样孵育后加抗体之前不需要洗板,加完抗体孵育后加HRP之前洗板3次,加完HRP孵育后显色前洗板5次。华美试剂盒标准品稀释液与样本稀释液为通用稀释液,优尔生没有样本稀释液,一般用PBS稀释。

  注:以上均为常见的试剂盒厂家,进口试剂盒及竞争法试剂盒仔细核对说明书后操作。

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