EMSA检测

一、项目介绍

EMSA 是一种用于研究核酸和蛋白质之间相互作用的技 术，适用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，主要是 验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋 白质的靶序列或已知序列的结合蛋白质分子。

二、实验步骤

1、 蛋白的提取

浆蛋白核蛋白提取（细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒）

1.1 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

1.2 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.3 对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

1.4 对于新鲜组织：

1 

1.1 

1.2 

1.3 

1.4 

1.4.1 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。

1.4.2 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。

1.4.3  4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)

1.4.4 对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。

1.4.5 

1.4.6 

1.4.7 

1.4.8 

1.4.9 

1.4.10 

1.4.11 

1.4.12 

1.4.13 

1.4.14 

1.4.15 

1.4.16 

1.4.17 

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1.4.19 

1.4.20 

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1.4.22 

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1.4.24 

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1.4.28 

1.4.29 

1.4.30 

1.4.31 

1.4.32 

1.4.33 

1.4.34 

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1.4.36 

1.4.37 

1.4.38 

1.4.39 

1.4.40 

1.4.41 

1.4.42 

1.4.5 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)

1 

1.1 

1.2 

1.3 

1.3.1 

1.3.2 

1.3.3 

1.3.4 

1 

1.3 

1.3.4 

1.4 

1.4.1 

1.4.2 

1.4.3 

1.4.4 

1.4.6 最高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)

1.4.7 冰浴10-15分钟。

1.4.8 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟。

1.4.9 最高速剧烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。

1.4.10 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。)

1.4.11  对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

1.4.12  最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。

1.4.13  4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

1.5  每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)

1.6  最高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)

1.7  冰浴10-15分钟。

1.8  加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟。

1.9  最高速剧烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。

1.10  立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。)

1.11  对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

1.12  最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。

1.13  4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

1.14  立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。

2、 制胶  （1.5mm胶，大约30分钟胶会凝）

待胶完全凝固后120v预电泳1h，缓冲液用预冷的0.5×TBE。

3、 蛋白与探针反应(注：蛋白浓度1 ug/uL ,上样体积2 uL)

混合后室温放置20分钟。

4、 上样

预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液，加5ul的5×上样缓冲液到样品混合液中，马上上样电泳。180v ，60min。

5、 电转移

将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10分钟。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE。300m A 30分钟。

6、 交联

转膜完成后将膜取出，放在一张干净的滤纸上，做好标记。于紫外灯下20cm处作用20分钟。

7、 封闭

将交联完成的尼龙膜取出放入洗净的孵育槽，用封闭液封闭20分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇)。

8、 抗体反应

   倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后，与膜完全作用30分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇).

9、 洗脱

        用1×的洗脱液清洗3次,每次5分钟。摇床速度加大。

10、平衡

用平衡液平衡5分钟。

11、ECL发光检测

12、图像分析（灰度比分析结果见EXCEl表格）