1. 为什么实验结果无阳性或阳性弱？

1) 一抗和二抗不匹配，使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。确保一抗和二抗的同种型匹配（例如，IgY和IgG）。

2) 没有足够的一抗与目标蛋白结合，提高一抗用量,建议4℃过夜孵育，延长孵育时间,增强抗原抗体结合，背景更低。

3) 由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效，由于储存和使用不当，导致抗体效价降低或失活，提高抗体浓度仍无阳性可做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

4) 样本中没有目标蛋白，通过查阅资料确认样本中是否存在某蛋白表达，若无可参考资料建议做阳性对照。

5) 样本中目标蛋白含量太少，应用信号放大操作，例如，使用生物素偶联二抗和偶联酶的链霉亲和素（SABC试剂盒）。

6) 脱蜡不彻底，延长切片脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。

7) 固定液封闭了抗体识别表位，固定时间过长会导致蛋白质空间结构发生折叠而遮盖抗原决定簇，可缩短样本固定时间，加强抗原修复。

8) 蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜，对样本进行破膜通透处理。

9) PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根，在抗体PBS储存液中加入适量防腐剂，或使用新鲜无菌的PBS。

2. 为什么我的片子背景很强而且非特异性着色很严重？

1) 未封闭或封闭不充分，延长封闭孵育时间，考虑更换封闭剂。推荐使用二抗种属来源的10%正常血清封闭1小时，或使用5% BSA封闭30分钟。另一种选择是用针对样品种属的Ig进行预吸附处理的二抗。

2) 一抗浓度过高，针对一抗做浓度梯度实验，选择合适浓度，缩短抗体和底物孵育时间。

3) 孵育温度过高，时间过长，选择4℃过夜或缩短孵育时间。

4) 二抗质量不佳，使用不加一抗的二抗对照。如果观察到二抗对照有染色，则更换二抗或使用针对样品种属Ig进行预吸附处理的二抗。

5) 内源性过氧化物酶含量过高，延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min。

6) 固定过度，福尔马林/PFA通常会在绿光光谱内产生自发荧光，因此试着使用红光范围内的荧光素。

7) 注意实验操作细节，在所有步骤（除封闭）之间加强PBS充分洗涤，孵育时候切勿干片。

8) 通透作用破坏膜并除去了膜蛋白，使用较温和的去垢剂（例如，用Tween 20代替Triton X）。或去除缓冲液中的透化剂。

9) 一抗与被染组织同源(如用鼠一抗检测鼠组织)，二抗会与同源的所有组织结合，使用种属来源不同于样本种属的一抗，或检测系统使用生物素直标一抗和酶偶联的链霉亲和素。

1. 检测出的分子量与理论分子量有差异

1) 翻译后修饰，比如磷酸化，糖基化等， 这些变化会增加蛋白的大小。

2) 蛋白变性后复性引起的二聚体， 三聚体，四聚体等形式，分子量可能是单体形式的二倍，三倍，四倍等。

3) 蛋白活化后剪切，比如很多蛋白在合成的时候是作为前体蛋白合成的，然后剪切形成活性蛋白片段形式，实际分子量变小。

4) 蛋白的电泳表观分子量与理论分子量有差别，例如p53蛋白，其表观分子量是53kDa (这也是该蛋白名字的由来) ，但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。

5) 许多蛋白质有多个亚型， 分子量都不同。

6) 可能是胶变形引起的，比对Marker出现偏差。

7) 蛋白质的降解。

2. Western blot结果中背景较高
可能的原因及建议：
1) 膜封闭不够
答：延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2) 一抗稀释度不适宜
答：对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度，降低抗体浓度。
3) 一抗孵育的温度偏高
答：建议4℃结合过夜。
4) 检测时曝光时间过长
答：减少曝光时间。

3. Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议：
1) 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
答：查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
2) 目的蛋白有其它剪切本
答：查阅文献或生物信息学分析可能性。
3) 样本处理过程中目的蛋白发生降解
答：加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
4) 上样量过高，太敏感
答：适当减少上样量。

5) 一抗或者二抗浓度偏高
答：降低抗体浓度。