稳转细胞系构建

　　简介：

　　稳转细胞系构建，基于某一细胞系构建持续过表达或者干扰某特定基因的细胞系。

　　外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达(永久表达)。 前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。

　　慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集;或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。

　　慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间稳定表达。
 

　　实验流程：

　　1、细胞培养：细胞复苏、传代、冻存

　　2、目的细胞药物筛选浓度确定-通过梯度实验

　　使用不同浓度的抗生素对细胞进行处理，筛选出在5-10天内使细胞全部死亡的最低抗生素浓度来进行下一步的筛选试验。不同的细胞对于同一种抗生素，其筛选浓度不同，而同一种细胞对于不同的抗生素，其最佳使用浓度也不同。所以在进行稳转株筛选之前，一定要先进行药物浓度筛选预实验以确定最佳药物筛选浓度。

　　3、慢病毒侵染目的细胞

　　根据公式计算病毒用量 (细胞数×MOI值/病毒原液滴度)×103=病毒用量(μl)

　　4、抗生素筛选细胞左右，使得稳定表达的细胞得以保留。

　　5、慢病毒稳转株检测，通过qPCR或者Western Blot检测目的基因

　　需要注意的是，mRNA的表达水平可能和蛋白的表达水平不一致，如果需要进一步研究蛋白的功能，可以使用WB检测蛋白的表达水平。
 

　　客户提供信息：

　　1.目的细胞名称及培养条件

　　2.实验目的：过表达或敲低;

　　3.慢病毒荧光、抗性、滴度等信息
 

　　样本寄送须知：

　　1.活细胞：不透气方瓶;

　　2. 冻存细胞：纯干冰件，保证干冰充足;

　　3. 慢病毒：-80℃ 纯干冰
 

　　交付结果：

　　实验报告，荧光照片，验证结果
 

　　结果展示：

　　实验器材展示：
 

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