基因合成/质粒构建/点突变

　　简介：

　　载体构建，又称质粒构建，基因克隆，分子克隆，DNA重组等。

　　基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。基因克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。质粒构建完成之后，可以通过引物引入点突变的形式，实现目的基因的点突变。

　　实验流程：

　　一、载体的选择

　　从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。公司已有的各类载体见附表1。

　　二、目的DNA片段的获得 —PCR扩增

　　根据序列信息，人工化学合成短片段拼接成目的DNA片段。

　　三、体外重组 —酶切+连接

　　四、导入受体细胞–质粒转化

　　载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。将连接之后的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，将其涂布在含有质粒抗性的LB固体板上。

　　五、重组子的筛选–抗性筛选-单克隆菌株挑选

　　一般质粒载体上都会含有原核抗性，如氨苄霉素，卡那霉素等，故而仅有转入目标质粒的大肠杆菌才能在抗性LB板种存活，并形成单一透亮的菌落。根据这一原理，对菌落进行挑取，摇菌(在含抗性的液体LB培养基中扩大培养，质粒会随着菌的复制而复制)，继而使用质粒提取试剂盒，提取大量的质粒。

　　六、阳性克隆的验证

　　①第一步，酶切或者跑胶的方式初步验证。

　　②第二步，进行测序分析，与目的基因序列进行比对，以最终确认目的基因。

　　客户提供信息：

　　1.目的基因的详细信息(种属，基因ID，NM号);

　　2.载体选择或者要求;

　　3.其他实验要求

　　样本寄送须知：

　　质粒载体等-20℃寄送

　　交付结果：

　　实验报告，测序结果，质粒
 

　　附表1

　　哺乳动物常规表达载体：

　　慢病毒表达载体：

　　双荧光素酶实验专用载体：

　　实验仪器展示：

PCR仪