石蜡切片荧光tunel实验报告

• 实验原理

荧光tunel：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

• 实验器材及试剂

1.主要实验器材

2.主要实验试剂

• 实验步骤

1、脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ8 min-二甲苯Ⅱ8min-二甲苯Ⅲ8min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗2min。 

2、微波修复:切片放入装满柠檬酸（6.0）修复液的修复盒中，微波修复中火8min，室温自然冷切，双蒸水洗涤3次，每次5min。

3、组织画圈：切片稍干后沿着组织用组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔3-4毫米的小圈，画完后用纯水洗涤3次，每次5min。

• 加试剂： 按1:50比例混合配制tunel工作液，TdT酶1ul＋对应颜色反应液50ul混合均匀；将tunel工作液加入到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育1.5小时，湿盒内加少量水保持湿度。浓度和孵育时间可以根据实验结果进行调节。

5、DAPI染核：切片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。吸干圈内多余PBS再滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

6、封片：切片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。将切片取出后用抗荧光淬灭封片剂封片。

7、镜检拍照：将切片置于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长361-389nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长540-580，发射波长594nm，发红光）。

• 结果判读

   DAPI染出的细胞核在紫外的激发下为蓝色，tunel试剂盒为绿色荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿光。