原位杂交（FISH和抗体共染）

服务介绍：

　　原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知序列核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。

原位杂交实验步骤：

1. 脱蜡至水

依次将切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-二甲苯Ⅲ15 min-无水乙醇10 min-90%酒精10 min-80%酒精10 min -70%酒精10 min -纯水冲洗。

2. 酶修复

细胞样本：等待切片完全干燥后，用组画笔（推荐HKR14P原位杂交专用组画笔）画出大小合适的疏水圈，在原位杂交仪中或湿盒中水平放置切片。将100ul蛋白酶K修复液(1X)滴于组织上，37℃孵育10min，纯水冲洗终止反应。

冰冻切片：细胞样本：等待切片完全干燥后，用组画笔（推荐HKR14P原位杂交专用组画笔）画出大小合适的疏水圈，在原位杂交仪中或湿盒中水平放置切片。将100ul蛋白酶K修复液(1X)滴于组织上，37℃孵育20min（冰冻切片），纯水冲洗终止反应。

石蜡切片：将装入玻片的玻片架放入修复槽，倒入1x柠檬酸6.0修复液（样本区域须被浸没），盖上盖子，用胶带纸封住，放入微波炉中，中火8min，停8min，中低火8min。自然冷却降温后，用3%双氧水封闭15min。

3. 封闭

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul封闭液，37℃孵育30min，洗涤1次，每次5min。洗涤步骤：将装入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（样本区域须被浸没），置于摇床上5min，转速为60。

4. 探针杂交

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul的探针，37℃孵育3h或过夜，注意保持湿度以防干片。洗涤5次，每次5min。洗涤步骤：将装入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（样本区域须被浸没），置于摇床上5min，转速为60。

5. 探针放大

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul的放大探针，37℃孵育1.5h，注意保持湿度以防干片。洗涤5次，每次5min。洗涤步骤：将装入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（样本区域须被浸没），置于摇床上5min，转速为60。

6. HRP-鼠抗地高辛

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul的HRP-鼠抗地高辛（1x），37℃湿盒孵育40min；洗涤5次，每次5min。洗涤步骤：将装入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（样本区域须被浸没），置于摇床上5min，转速为60。

7. 显色

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul的TSA显色液，室温孵育10min。纯水冲洗，终止反应。

8. 抗体洗脱

将装入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入抗体洗脱液（样本区域须被浸没），室温孵育10min，纯水洗5次，每次5min。

9. 加一抗

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul按1:200稀释的抗体工作液，4℃孵育过夜。PBS缓冲液洗涤5次，每次5min。

10. 加二抗

甩干切片上的液体，每张切片滴加即用型POLY-HRP羊抗兔鼠通用二抗，室温孵育1h。PBS缓冲液洗涤5次，每次5min。

11. 显色

甩干切片上的液体，每张切片滴加100ul的TSA显色液，室温孵育10min。纯水冲洗，终止反应。

12. DAPI染核

每张切片滴加50ul DAPI染液，避光孵育10min，纯水冲洗后滴加封片剂封片。